Nya metoder att analysera diffraktionsdata från röntgenlasrar

Den 16 mars publicerade Nature Methods artikeln ” Accurate macromolecular structures using minimal measurements from X-ray free-electron lasers”. Bland författarna finns Jonas Sellberg som är doktorand vid Fysikum. Han har bidragit till att utveckla tekniken för injektion av mikrojetstrålar av kristaller i vakuum som möjliggjort kristallografi med röntgenljus från frielektronlasern LCLS.

Det senaste årtiondet har partikelacceleratorer fått ett nytt användningsområde: de har skapat världens första röntgenlasrar som totalt har förändrat spelreglerna för att studera atomer och molekyler. Plötsligt kan man skapa ultrakorta röntgenpulser innehållandes över 1E12 fotoner per puls, så att det finns möjlighet att avbilda nanokristaller eller rent utav enskilda makromolekyler utan att atomerna hinner röra sig. Detta torde revolutionera strukturbiologi som hittills varit beroende av stora kristaller för att få tillräckligt stark signal i diffraktionsmönstren utan att röntgenstrålningen skadar kristallstrukturen. Än så länge har dock endast ett fåtal studier kunnat ge lika hög upplösning som de mer traditionella strukturbestämningarna vid synkrotronljuskällor. Anledningen till detta är att varje kristall som träffas av röntgenlasern förstörs av en enskild röntgenpuls, vilket kräver ett förnyelsebart prov och därmed gör det omöjligt att mäta samma kristall från olika vinklar; nya kristaller måste genereras mellan varje röntgenpuls för att ge upphov till nya diffraktionsmönster. Forskarna har löst detta genom att skapa en jetstråle av kristallösning (se figur 1A) som skjuts in i vakuum där den träffas av röntgenlasern, men detta kräver en hög koncentration av dyrbara kristaller som tyvärr sällan är helt identiska (se figur 1B). Samtidigt är stråltid vid en röntgenlaser extremt dyr, och kostar per användartimme t.ex. vid LCLS-lasern vid SLAC i USA, som är världens första hårdröntgenlaser, ca 200 000 SEK av de amerikanska skattebetalarnas pengar. Dessa förhållanden ställer höga krav på nya metoder som optimerar användningen av stråltid och kristaller.

I en nyligen publicerad studie i Nature Methods utvecklade ett internationellt forskningsteam lett av Nicholas Sauter en ny programvara cctbx.xfel som är ”open source” och kan laddas ner här med en introduktion här. För att testa den nya programvaran användes diffraktionsdata från kristaller av enzymerna termolysin (se figur 1C) och lysozym. Dataseten hade uppmätts av olika forskargrupper och är tillgängliga från en databas för diffraktionsdata uppmätt vid röntgenlasrar. Den nya programvaran möjliggjorde att dubbelt så många kristaller kunde användas för strukturbestämning jämfört med tidigare programvara, utan att försämra upplösningen. Faktum är att endast 1 700 kristaller bidrog till den höga upplösningen på 2.1 Å för termolysin, vilket är ca 10 gånger färre än tidigare metoder som har använts. Strukturen har lagrats i proteindatabasen (PDB, ID: 4OW3).

Figur 1. Övergripande bild av diffraktionsexperiment på mikrokristaller av termolysin (B) som färdas i lösning genom en glaskapillär som skapar en elektrospunnen mikrojet (A) i en vakuumkammare innan de träffas av röntgenlasern. Enskilda diffraktionsmönstrer av mikrokristallerna mäts på en detektor (CSPAD) och kan summeras ihop till ett tydligare puderdiffraktionsmönster (C). Figuren är gjord av Greg Stewart vid SLAC och är anpassad från R. G. Sierra et al. Acta Cryst. D68, 1584-1587 (2012).
Figur 1. Övergripande bild av diffraktionsexperiment på mikrokristaller av termolysin (B) som färdas i lösning genom en glaskapillär som skapar en elektrospunnen mikrojet (A) i en vakuumkammare innan de träffas av röntgenlasern. Enskilda diffraktionsmönstrer av mikrokristallerna mäts på en detektor (CSPAD) och kan summeras ihop till ett tydligare puderdiffraktionsmönster (C). Figuren är gjord av Greg Stewart vid SLAC och är anpassad från R. G. Sierra et al. Acta Cryst. D68, 1584-1587 (2012).

Jonas Sellberg är doktorand vid Stockholms Universitet och har genom sin handledare Anders Nilsson fått möjligheten att forska vid SLAC i Kalifornien, USA, i tre år. Under tiden arbetade han bland annat tillsammans med Michael Bogan, Hartawan Laksmono, Raymond Sierra, m.fl. med att testa lämpliga munstycken för att skapa jetstrålar som använder så små mängder av de dyrbara, biologiska kristallerna som möjligt. Forskningsgruppen utvecklade en elektrospunnen jet (se figur 2) som endast förbrukade 0.14-0.31 µl/min, vilket är ca 100 gånger lägre flöde än vad som har krävts för tidigare mätningar vid strålröret CXI som specialiserar på strukturbestämningar genom diffraktionsdata från biomolekyler. Studien publicerades i Acta Crystallographica Section D och är en i raden av flera lyckade projekt som banade vägen för att kunna mäta den intakta strukturen av fotosystem II vid rumstemperatur genom simultan röntgendiffraktion och röntgenspektroskopi, som publicerades i Science förra året.

Det internationella samarbetet är ett bra exempel på möjligheterna som finns kring den nya forskningen med röntgenlasrar. Anders Nilsson fick nyligen ett anslag från VR på 125 000 000 SEK för att flytta från SLAC och Stanford University till Stockholms universitet och således stärka universitetets ställning som ett framstående forskningssäte inom röntgendiffraktion och röntgenspektroskopi.

Figur 2. Optiska bilder på en elektrospunnen mikrojet som är skapad av en spänning på 2-4 kV mellan en motelektrod och en glaskapillär med 50 µm innerdiameter och 150 µm ytterdiameter. I den vänstra bilden är mikrojeten upplyst av en vanlig halogenlampa och endast Taylorkonen där mikrojeten skapas är synlig. I den högra bilden belyses mikrojeten av en Nd-YLF laser med en våglängd på 527 nm och den µm-tunna jetstrålen. Den optiska lasern användes för att excitera fotosystem II och studera hur metalloenzymet med hjälp av solljus omvandlar vattenmolekyler till syrgas och vätejoner.
Figur 2. Optiska bilder på en elektrospunnen mikrojet som är skapad av en spänning på 2-4 kV mellan en motelektrod och en glaskapillär med 50 µm innerdiameter och 150 µm ytterdiameter. I den vänstra bilden är mikrojeten upplyst av en vanlig halogenlampa och endast Taylorkonen där mikrojeten skapas är synlig. I den högra bilden belyses mikrojeten av en Nd-YLF laser med en våglängd på 527 nm och den µm-tunna jetstrålen är då synlig. Den optiska lasern användes för att excitera fotosystem II och studera hur metalloenzymet med hjälp av solljus omvandlar vattenmolekyler till syrgas och vätejoner.

Den nya studien är resultat av ett internationellt samarbete mellan USA, Tyskland, Sverige, Storbritannien och Frankrike som leds av Vittal Yachandra, Junko Yano och Nicholas Sauter vid Lawrence Berkeley National Laboratory och Uwe Bergmann vid SLAC i Kalifornien. Från Stockholms Universitet deltog Jonas Sellberg.

Mer läsning
Det nyligen publicerade Nature Methods-arbetet om metodutveckling av Johan Hattne et al. kan läsas här.
Det tidigare publicerade Science-arbetet om fotosystem II av Jan Kern et al. kan läsas här.
Beskrivning av LCLS finns här.

– Jonas Sellberg (jonas.sellberg@fysik.su.se)

Share this post
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *